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稳定同位素示踪技术确证PHB-GA代谢途径中羧基迁移机理

2021-12-28 11:48     来源:元素与示踪     稳定同位素同位素示踪法
01 前言概述

微生物代谢国家重点实验室的周宁一团队在基因和酶学水平发现了微生物通过龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸,gentisate, GA)分解代谢对羟基苯甲酸(para-hydroxybenzoate, PHB)过程中羧基分子内迁移的分子机理,详细阐明了一种新颖的基团迁移机制和一条“弃简从繁”的PHB-GA代谢途径。以上海化工研究院制备的稳定同位素标记对羟基苯甲酸-13C为示踪剂,证明了PHB转化为GA的过程中,羧基发生了分子内的迁移和保留。这一羧基分子内迁移模式的发现揭示了硫酯化合物在生物化学过程中新的功能,并体现了微生物分解代谢芳香化合物途径的多样性。

相关成果“The molecular basis for the intramolecular migration (NIH shift) of the carboxyl group during para-hydroxybenzoate catabolism”发表在国际知名期刊《Molecular Microbiology》上(IF=4.9)

# 应用文章

02 案例分享

研究目标

探究微生物通过龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸,gentisate, GA)分解代谢对羟基苯甲酸(para-hydroxybenzoate, PHB)过程中羧基分子内迁移的分子机理。

菌株PHB-7a将PHB转化为GA

为了确定菌株侧孢短芽孢杆菌PHB-7a将PHB全细胞转化为GA途径的基因是否被诱导表达,用PHB对侧孢短芽孢杆菌 PHB-7a进行处理,经HPLC分析,PHB处理的细胞与未处理的细胞相比,PHB下降的速度要快得多,证实了PHB向GA转化所涉及的编码酶的基因是可诱导的。

基因组分析鉴定GA分解代谢相关基因

基因组测序结果表明,侧孢短芽孢杆菌PHB-7a的染色体全长为5.44Mb,GC含量为38.2%。菌株中还含有0.08Mb质粒。

生物信息学分析表明,在侧孢短芽孢杆菌中,有4个基因簇与功能鉴定的bagXILK簇高度相似,该基因簇通过GA参与MHB的分解代谢。

PHB向GA转化过程中上调基因的定位

转录组分析显示,在PHB处理的细胞中,共有39个基因表达上调。通过生物信息学分析表明,两个簇中的7个基因(包括基因bagXILK和phgABC)被注释为编码芳香族分解代谢的酶,利用NCBI的保守结构域数据库软件对phgABC的产物进行了分析后,提出了PHB分解代谢途径。

大肠杆菌转化PHB为GA

构建大肠杆菌BL21(DE3)[PETDuet-phgABC],通过全细胞生物转化的方法检测转化菌株将PHB转化为GA的能力,结果表明,pETDuet-phgABC、pETDuet-phgAB、pETDuet-phgAC、pETDuet-phgBC均可使大肠杆菌BL21(DE3)转化PHB为GA。

分析验证

通过LC-L-TQ MS/MS/MS分析PhgC分解产物并与化学合成的对羟基苯甲酰-辅酶A进行比较,证实产物为对羟基苯甲酰-辅酶A。经分析验证,证明PhgC是催化PHB转化为对羟基苯甲酰-CoA的对羟基苯甲酰辅酶A连接酶。

同理,经实验验证PhgA是一种催化对羟基苯甲酰辅酶A向龙胆酰辅酶A转化的对羟基苯甲酰辅酶A羟化酶,PhgB是一种龙胆酰辅酶A硫酯酶,催化龙胆酰辅酶A水解为GA。

羧基迁移

稳定同位素标记的2,3,5,6-四氘-PHB作为底物被用来确定羧基的迁移,[羧基-13C]-PHB被用来确定原始羧基的保留。通过LC-MS和HNMR证明了PHB向GA转化过程中的羧基迁移是由PhgABC催化的。

总 结

上海化工研究院生物医药检测中心为其提供提供了稳定同位素示踪剂:13C-对羟基苯甲酸。

通过对微生物分解代谢过程中13C富集度测试,确证微生物通过龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸,gentisate, GA)分解代谢对羟基苯甲酸(para-hydroxybenzoate, PHB)过程中羧基分子内迁移的分子机理,阐明了基团迁移机制和PHB-GA代谢途径。

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