热点关注:  
放射性同位素 粒子加速器 辐照杀菌 无损检测 高新核材 辐射成像 放射诊疗 辐射育种 食品辐照保鲜 废水辐照 X射线 中广核技 中国同辐

运用氮稳定同位素技术鉴别有机番茄

2021-12-31 13:53     来源:生命科学实验     稳定同位素氮15
有机食品是指根据有机农业生产的规范生产加工并经过认证的农产品和加工品。有机食品禁用化肥,允许施用有机肥,土壤有机肥的施用是种植业有机产品生产的主要控制要素。研究表明,化学肥料中δ15N的丰度变化范围小,平均值为0.2‰,而有机肥料中δ15N的丰度变化范围大,平均值为8.5‰,有机肥中15N同位素丰度高于化肥中15N丰度。有机模式种植的农产品主要施用有机肥,不施用化肥,因此致使农产品中氮同位素比值(δ15N)存在差异,通常表现为有机产品中δ15N高于施用化肥的普通产品。农产品中δ15N丰度依次为施用有机肥>不施肥(土壤内源氮)>施用化学合成氮肥。因此,利用氮稳定同位素结合化学成分的变化,可以甄别有机番茄与普通番茄。

一、实验方法

1、样品准备

选取番茄样品共计94个,包括宝石、大红、3944、安哥拉等大果番茄品种,其中有机番茄样品50个,普通番茄样品44个。采集获得的番茄样品洗净切片,混匀后,用匀浆机打碎,冷冻干燥成粉末,过20 目筛放于-80 ℃备用。

2、HPLC-HRMS分析

冻干后的样品,称量约150 mg,加入3 mL水-乙醇(1∶4,V/V),超声30 min后,4 000 r/min离心15 min, 取2 mL上清液于氮气流下挥发(45 ℃)至近干。残渣加水-甲醇(1∶4,V/V)2 mL进行复溶,超声30 min, 4 ℃、14 000 r/min离心15 min,过0.22 μm滤膜,分取1.5 mL上清液于液相进样瓶中,进行分析。

3、氮同位素比值测定

冻干后的样品,分别称量约2 mg,并用锡杯包裹压实,利用元素分析仪-同位素比值质谱仪测定稳定氮同位素比值,并根据下式计算δ15N值。

4、液相色谱条件

采用Waters Atlantis T3色谱柱(2.1 mm×150 mm, 3 μm);流动相为0.1%甲酸-乙腈溶液(A)和0.1%甲酸溶液(B);流速0.3 mL/min;柱温45 ℃;梯度洗脱条件:0~0.5 min,5%A,95% B;0.5~5 min,5%~30%A,95%~70% B;5~9.5 min,30%~90% A,70%~10% B;9.5~9.75 min,90%~5%A,10%~95% B;9.75~12 min, 5%A,95% B;进样体积5 μL。

5、高分辨质谱条件

电喷雾离子源;喷雾电压3.2 kV;蒸汽温度350 ℃;离子传输管温度320 ℃;鞘气流速35 arb;辅助气流速15 arb;Full MS-ddMS2扫描模式,Full MS质量扫描范围m/z 100~900,一级分辨率70 000,二级分辨率17 500。

6、同位素比值测试条件

元素分析系统氧化柱填料Cr2O3/Co3O4,温度为960℃,还原柱填料为高纯Cu/CuO,温度为640 ℃,载气He流量为90~100 mL/min,氧喷条件为175 mL/min。

二、实验结果

1、稳定同位素比值分析

(1)有机与普通番茄稳定氮同位素比值的差异分析

利用元素分析仪-IRMS测得不同地区50 种有机种植番茄样品以及44 种普通种植番茄样品,结果显示,有机番茄δ15N值的中位值在8.68‰左右,而普通方式种植的番茄δ15N值的中位值则为3.61‰,有机番茄氮同位素比值明显高于普通番茄。有机番茄的肥料主要为有机肥,普通番茄主要施用化肥。有机肥以畜禽粪便、动植物残体等富含有机质的副产品资源为主要原料,植物氮源主要来自于土壤中动植物腐烂物质及动物排泄物。由于15N与14N在生物体内反应所需能量不同,反应速率存在差异,造成15N在生物体内产生富集。因而有机肥15N丰度高于化肥,有机肥中高含量的15N使有机作物果实中15N比例增高。

(2)番茄与对应的土壤氮同位素变化特征

番茄与对应土壤的δ15N值对比发现,有机番茄的氮同位素比值均高于对应的土壤同位素比值;在土壤氮源中δ15N丰度差异不显著的情况下,施用外源肥料后,有机番茄主要吸收有机肥中的高δ15N的有效氮,导致有机番茄中δ15N高于土壤的δ15N,普通番茄吸收无机肥的低δ15N有效氮,导致普通番茄的同位素比值低于土壤同位素比值。

2、液相色谱高分辨质谱分析番茄化学组成成分

(1)液相色谱分析结果

分别采集番茄样品的HPLC-HRMS正离子和负离子模式的总离子流色谱图。下图为具有代表性的有机番茄样品正离子模式指纹图谱。在正离子模式下共有约25 个明显可见的色谱峰,而在负离子模式下,样品出峰较少。

(2)有机番茄和普通番茄组成成分的差异性分析

94个样品的色谱峰面积经SIMCA-P软件剔除异常值样品,获得符合要求的样品91个,随机取56个作为训练集,其中有机样品28个,普通样品28个,35个作为验证集样品,其中有机样品20个,普通样品15个。应用Compound Discover软件,对色谱峰进行峰对齐、保留时间校正和滤噪处理后,提取其中的所有质谱信息。使用软件的化合物筛查过滤模式,提取化合物峰面积大于10^5,且60%以上样品都有响应的化合物组成成分,提取其中的875个化合物的峰面积数据。采用SIMCA-P软件进行PCA和PLS-DA,PCA不能将样品很好分开,采用PLS-DA提取3个PC,模型解释的训练集累计贡献率(RY2)达到0.915。采用Permutation校验方法验证模型是否存在过拟合现象,建立的模型能够实现2 组样本完全分离,模型的总预测正确率为92.3%。

模型对有机和普通番茄的判定结果

应用Compound Discover软件,对番茄样品的HPLC-HRMS组间数据峰面积均值进行比对,形成单变量统计分析结果的火山图,共有18个特征化合物存在显著差异,这些化合物成分在有机和普通番茄中存在较大差异,需进一步确证。

与普通番茄相比,有机番茄中含量增加(a)和含量减少的化合物(b)

(3)δ15N与HPLC-HRMS组合的特征变量因子分析

将SIMCA-P软件多变量处理结果与Compound Discover软件单变量分析的结果相结合,进一步筛选特征化合物,以更全面阐明有机和普通样品之间的差异化合物成分。单变量处理的组间存在显著差异(P<0.05)的219 个变量中,满足多变量处理变量重要性投影(VIP)大于1.0的变量153 个,其中VIP值大于1.5的变量53 个,这53 个化合物可能成为有机番茄和普通番茄具有显著差异的特征化合物。这些化合物与采用Compound Discover处理的火山图结果中的18 个化合物中有14 个一致,这14 个成分中有9 个化合物在有机番茄中含量低于普通番茄,有5 个高于普通番茄,说明通过简单的化合物峰面积比较可初步发现存在含量差异的化合物。


 

针对筛选出的除δ15N以外的152 个变量,通过精确分子质量、二级质谱分析,并检索mzclound、chemspider、massbank、KEGG等数据库,结合文献,初步确定mzclound数据库匹配度大于70%,在有机与普通番茄中存在差异的13 个化合物,见下表。在这些化合物中,主要为有机酸、黄酮类化合物,这两类化合物是番茄中的主要抗氧化成分。与普通番茄组相比较,有机番茄中的小分子有机酸含量降低,黄酮类化合物槲皮素-3-O-三糖苷的含量增加。这与已有研究结果基本一致,环境胁迫可激活番茄植株体内苯丙醇类化合物的生物合成,有机处理的番茄中类黄酮含量随种植年限增加而增加,而传统处理的类黄酮含量并无显著差异。

两组间差异显著的化合物信息

三、实验结论

有机和普通种植方式所生产的番茄,其果实中稳定氮同位素比值差异显著,可结合地区特征,通过稳定氮同位素比值大小在一定程度上判定样品是否为有机番茄。为进一步提高判别效果,将液相色谱高分辨质谱分析数据与稳定碳同位素比值相结合,构建了有机番茄判别模型,筛查出特征变量因子,包括稳定氮同位素比值,50多个可能的化学成分,鉴定出其中的13 个化合物,可作为有机和普通番茄区别的特征成分。所建立的模型对有机番茄的判别正确率为93.4%,基本可以满足有机番茄判别的需要。对有机产品的判定,稳定氮同位素差异分析更为简洁方便,但由于有机与普通产品的稳定氮同位素比值界限时有重叠,给判定增加了不确定性,因此应该进一步结合液相色谱-串联质谱的组学技术,提高判别的可靠性。


推荐阅读

稳定同位素分析重建泥河湾盆地麻地沟古人类生存环境

中国科学院古脊椎动物与古人类研究所裴树文研究团队联合复旦大学科技考古研究院和西班牙高级科学研究委员会历史研究所研究人员,首次采用哺乳动物牙釉质碳氧稳定同位素分析方法,重建了泥河湾盆地麻地沟遗址古人类生存时期的古环境,并结合石器技术分析尝试探讨了人类行为适应性的相关问题。 2021-12-28

稳定同位素示踪技术确证PHB-GA代谢途径中羧基迁移机理

微生物代谢国家重点实验室的周宁一团队以上海化工研究院制备的稳定同位素标记对羟基苯甲酸-13C为示踪剂,证明了PHB转化为GA的过程中,羧基发生了分子内的迁移和保留。 2021-12-28

蛋白质的营养价值——一项新的核技术揭示了什么?

测量氨基酸吸收的标准方法是侵入性的,或者容易受到消化道中细菌对蛋白质合成的干扰。一种新的同位素技术,即双稳定同位素示踪法,提供了更准确的测量结果。 2021-12-22

稳定同位素氮15标记示踪剂确证APRI对番茄和土壤硝酸盐利用和迁移的影响

杭州电子科技大学的研究团队选择西红柿作为研究对象,采用氮15(15N)示踪技术和模拟土柱法,由上海化工研究院提供K15NO3示踪剂及15N丰度检测技术研究了APRI对残留硝酸盐迁移利用的影响。 2021-12-07

利用核技术对抗土壤盐碱化:国际原子能机构纪念世界土壤日

今年世界土壤日的主题是 "阻止土壤盐碱化,提高土壤生产力”。同位素技术在许多国家被用来研究土壤退化的程度和原因,使决策者掌握正确的数据来保护土壤。 2021-12-05

阅读排行榜