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利用X射线晶体学及冷冻电子显微镜成像技术确定大分子结构

X射线 X射线晶体学 成像技术 电子显微镜
发布:2020-12-28 14:24:36    

生物大分子采用的三维结构在很大程度上决定了它们在不同细胞过程中的作用。从X射线晶体学到冷冻电子显微镜的几种不同的成像技术已成功地用于众多大分子的结构表征。

图片来源:Sergei Drozd / Shutterstock.com

什么是大分子?

尽管多达80%的生物由小分子组成,包括无机离子,有机分子,主要是水,但生物的其余部分则由大分子组成。大分子可以是蛋白质,多糖或遗传物质(如脱氧核糖核酸(DNA))的形式。

例如,蛋白质是细胞内存在的最丰富的细胞大分子类型,因为蛋白质通常占细胞总重量的20%。细胞内存在的许多蛋白质都是酶,它们负责催化重要的生化反应,从而为细胞提供能量和营养。除酶外,其他蛋白质功能还有助于细胞的整体运动,维持细胞的刚性,并支持分子跨细胞膜的运输。

先进的细胞成像方法

高分辨率细胞成像模式发展的最新进展使科学家具有研究自然环境中发生的生物过程的能力。

随着这些成像方法的不断发展,研究人员不仅对确定大分子在不同细胞反应中的作用感兴趣,而且对扩展有关这些大分子结构的当前知识也很感兴趣。

实际上,了解大分子的结构是了解其功能的核心,因为许多分子(尤其是酶)将采用复杂的三维(3D)结构来催化特定的化学反应。

传统上,已经通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)光谱研究了大分子的结构。尽管传统的X射线成像不足以研究单个蛋白质复合物,但是当这些大分子的多个副本一起排列在3D晶体中时,X射线晶体学可以提供有关蛋白质的重要​​结构信息。

类似地,测量原子之间距离依赖的相互作用的NMR也可用于推断某些大分子的结构,以确定它们在与其他分子相互作用时的动力学和行为。

几种其他成像方法已用于大分子结构测定,其中一些包括透射电子显微镜(TEM),单颗粒分析,3D重建,冷冻电子显微镜(cryo-EM)和电子冷冻断层摄影(cro-ET)。

用电子显微镜技术确定大分子结构

据估计,蛋白质以比它们的X射线散射模式高出一万倍的明显强得多的速度散射电子。从这些大分子散射的电子可以在某些电场中加速,以提供有关组成这些大分子的原子之间存在的距离的信息,从而可以精确地计算它们的结构。

尽管与利用X射线晶体学和NMR的电子显微镜(EM)技术的先前应用相比,其在大分子结构表征方面的应用是适度的,但是EM技术的最新进展已经改变了结构生物学的研究。

与在成像后破坏蛋白质样品的传统EM技术相比,cryo-EM可以使样品在低温下保持冷冻,可以保护蛋白质免受辐射破坏的破坏,同时在暴露于EM的高真空下也可以保护其结构系统。

蛋白质样品的典型冷冻EM成像将需要将几微升样品施加到置于金属格栅顶部的无定形碳材料薄膜上。

将多余的液体吸干后,将金属栅格放入液态乙烷中以产生一层薄薄的玻璃冰,使蛋白质的多个副本自身排列成不同的方向,同时保持样品的超微结构。

通过使用在液氮温度下操作的电子显微镜,然后通过存在于无定形碳膜中的孔获得蛋白质样品的多个二维(2D)图像。这些图像合在一起,将用于创建蛋白质的高分辨率单3D结构。

合并图像后,可以通过称为子断层图平均的方法确定大分子结构,该方法将标本的重复3D密度组合在称为断层图的重建体积内。

未来展望

诸如cryo-EM和cryo-ET之类的先进成像技术已经满足了对可视化细胞内存在的大分子的微小细节的不断增长的需求。

例如,当将这种技术应用于细菌标本时,它们可以提供有关细菌大分子的结构信息,这些结构负责抗菌性和细菌致病性。

这类信息不仅可以改善对这些微生物的行为和活性的基本了解,而且还可以用于设计旨在消除和/或规避抗菌素耐药性的治疗策略。

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